这么牛？最新最全WB实验操作及原理
一、实验原理
本实验使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，将细胞或组织样本中的蛋白质分离并转移到固相支持物PVDF或NC膜上。然后，使用特异性抗体与目标蛋白结合，并使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体进行反应，通过底物显色来分析曝光条带的位置和灰度分析，以获得目标蛋白在样本中的表达情况。
二、实验流程
（1）样本制备，包括蛋白质提取、定量、变性；
（2）SDS-PAGE凝胶电泳；
（3）转膜：通过电转转移到PVDF、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相支持物上；
（4）封闭：膜上非特异性位点通过脱脂牛奶/BSA封闭；
（5）一抗、二抗孵育；
（6）ECL化学发光检测（显影）；
（7）胶片灰度分析及数据处理：内参作为特定蛋白进行半定量分析；
三、实验器材(看图）
四、详细步骤及注意事项
4.1 样本制备
贴壁细胞总蛋白提取：用TBS（Tris缓冲液）冲洗细胞三次，最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂PMSF或cocktail）于培养板内3-5分钟。期间反复晃动培养板，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12000g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液，样品分装冻存于-20℃备用。
注意事项及原理：a.冲洗细胞使用TBS而不是PBS的原因：PBS是磷酸盐缓冲液的简称，是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，适用的pH范围宽、pH受温度的影响小、缓冲液稀释后pH变化小。但易与钙离子镁离子络合形成沉淀；会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制；若配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基膦酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基磷酸钾。目前在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中都已使用Tris缓冲液而很少再使用磷酸盐溶液。Tris缓冲液对生物化学过程影响很小，且不与钙离子镁离子发生作用。

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