乳酸通过糖酵解和脂肪分解的调控维持稳态
美国普林斯顿大学化学系Joshua D. Rabinowitz 团队在Cell Metabolism发表一研究项目，题目：Lactate homeostasis is maintained through regulation of glycolysis and lipolysis
论文要点
1.胰岛素同时增加乳酸的生成和消耗
从喂食比空腹状态下的小鼠胰岛素高出4倍，而血液中乳酸水平不发生改变的结果，作者想探究胰岛素是否影响乳酸代谢。在给小鼠注射低剂量胰岛素（0.5/0.1单位/千克体重），发现循环乳酸浓度在4分钟内升高超过2倍，随后在接下来的5分钟内迅速下降至基础水平。胰岛素诱导乳酸升高是因为外周组织对葡萄糖的摄取以及糖酵解作用，但是乳酸水平升高是不在预期的，这点引起了作者的关注。
通过高胰岛素-正常血糖钳夹实验（胰岛素钳夹）实验，作者发现无论是持续输注胰岛素（1.25毫单位/分钟/千克体重）还是2.5毫单位/分钟/千克体重，血液乳酸浓度始终没有变化。以上结果说明，胰岛素不仅可以增加乳酸的生成，也能够促进其消耗。
2.胰岛素诱导乳酸氧化
用¹³C标记的乳酸来探究胰岛素如何影响乳酸的代谢。结合胰岛素钳夹实验，发现胰岛素使得乳糖来源的葡萄糖变少，反映出了对糖异生的抑制作用，可导致乳酸的累积。有趣的是，乳酸来源的谷氨酰胺水平增加，因为谷氨酰胺的碳骨架来源于TCA循环中的α-酮戊二酸，指示着胰岛素增加了乳酸在TCA循环中的分解代谢。此外，在多种组织中发现了胰岛素促进了乳酸在TCA循环中的分解代谢，尤其在红肌中非常明显，因为红肌在全身乳酸清除和能量消耗中发挥着关键作用。
乳酸的最终代谢产物为CO₂，在空腹基础状态以及胰岛素钳夹状态下，两者的CO₂生成速率保持一致，然而来源于乳酸的CO₂生成的贡献在胰岛素作用下显著增加，大约提升了50%，以此结果，作者得出：胰岛素除了促进糖酵解抑制糖异生增加乳酸水平外，还通过TCA循环诱导了乳酸的氧化利用。
3.胰岛素通过降低脂肪酸促进乳酸氧化
进一步探究胰岛素促进乳酸氧化的机制，作者发现胰岛素钳夹状态下相比于基础状态，呼吸交换率（RER）显著上升，说明胰岛素促使从脂肪酸的利用向碳水化合物的利用转变。根据此结果，作者提出假设：脂肪酸与乳酸在代谢中存在竞争关系，二者被用于满足能量需求。正如假设所想，实验结果显示，胰岛素钳夹实验对脂解产生了抑制作用循环脂肪酸水平下降了约50%，而乳酸氧化则随之增加。
脂肪乳（intralipid）输注实验显示出，肌肉中胰岛素信号在intralipid输注期间依然保持正常。然而，intralipid输注完全抵消了胰岛素增强乳酸TCA氧化的作用。与此一致的是，¹³C-亚油酸来源的TCA中间产物在胰岛素作用下减少，而在intralipid输注时恢复。
以上结果说明，胰岛素通过降低脂肪酸来促进乳酸的氧化利用。
4.HCAR1抑制脂解促进了乳酸稳态
为了深入探究调节乳酸稳态的分子机制，进行L-乳酸钠的输注实验，对照组为相匹配的氯化钠溶液。在输注L-乳酸钠后，血液中乳酸水平提高了约3倍，而血糖和胰岛素水平未发生改变。另外，乳酸的输注使得循环中的脂肪酸水平下降了约40%，暗示着乳酸本身可能就调控着脂解。
HCAR1（羟基羧酸受体1，也称为GPR81）是一种由乳酸激活的G蛋白偶联受体，主要表达在脂肪细胞的质膜上。当乳酸与HCAR1结合后，该受体通过抑制G蛋白（Gi）传导信号，从而抑制cAMP生成、蛋白激酶A（PKA）信号传导及脂解作用。
为探究乳酸对于脂肪酸的抑制作用知否是通过HCAR1介导的，作者对其进行了敲除（HCAR1 KO）。在基础状态下，HCAR1 KO除血糖略高外，脂解通量以及乳酸对于TCA中间产物的贡献在KO组和WT组中相同。在输注乳酸60分钟后，KO组血糖水平升高，乳酸水平不变，但两组脂肪酸水平均下降，但WT组下降幅度更大，说明乳酸抑制脂解的效应部分依赖于HCAR1。除此之外，KO组乳酸水平的升高显著的提升胰岛素水平，这可能是的在没有HCAR1的情况下，通过诱导胰岛素的分泌降低脂解。
接下来作者通过使用HCAR1激动剂HY-135982进行代谢组学以及¹³C-乳酸追踪监测，发现在WT组中，循环中脂肪酸水平迅速下降，且乳酸对肌肉TCA中间产物的相对贡献增加，说明乳酸在肌肉中的氧化增强。
以上结果表明，血液乳酸水平升高可部分通过HCAR1抑制脂解，从而促进外周组织中乳酸的线粒体氧化。
5.乳酸反馈抑制自身的生成
升高的循环乳酸浓度在临床上与胰岛素抵抗密切相关，也可在动物模型中诱发胰岛素抵抗。为了研究乳酸对胰岛素作用的急性影响，实验先对小鼠进行L-乳酸钠注射，再进行胰岛素的注射。结果显示，乳酸的注射阻碍了胰岛素的降血糖作用。除此之外，作者发现胰岛素钳夹实验中，仅靠乳酸的持续输注，就足以在该低剂量胰岛素钳夹下维持正常血糖水平而无需外源性葡萄糖输注。因此，乳糖浓度的升高可以显著的抑制胰岛素的降糖作用，提示其在胰岛素抵抗的发生中具有潜在的功能性角色。
在胰岛素钳夹实验中，当乳酸作为主要的糖异生底物时，研究发现内源性葡萄糖的生成（EGP）通量提高了约约40%，肝脏中的胰岛素信号并未受到影响。另外，外周组织对于葡萄糖的清除能力减少了将近一半，几乎几乎完全抵消了胰岛素对系统性葡萄糖摄取的促进作用。
此外，由于乳酸抑制了胰岛素诱导的葡萄糖的摄取，导致内源性的乳酸生成减少约20%，阻止了乳酸水平的进一步上升。而乳酸的清除通量则没有显著变化。综上，乳酸通过抑制胰岛素诱导的葡萄糖分解代谢，从而负反馈地抑制了自身的生成。
6. 高乳酸血症扰乱肌肉的胰岛素信号传导
进一步探究乳酸如何影响胰岛素调控葡萄糖的分解代谢的，在此方向作者主要把重点关注在了骨骼肌上，因为骨骼肌是全身葡萄糖的代谢和乳酸生成的主要部位。在胰岛素钳夹实验中注射丙酮酸，产生了与乳酸类似的效果，说明真正导致葡萄糖分解受抑的是过量的三碳中间产物，而非胞质NADH的积累。
此外，经典的胰岛素抵抗机制包括，血液中脂肪酸的水平上升，ATP和柠檬酸的累积。作者胰岛素钳夹实验后（有或无乳酸注射）直接测量了骨骼肌中的NADH、NAD⁺、ATP、ADP、AMP、柠檬酸、DAG、神经酰胺及糖酵解中间产物的水平，结果未观察到这些代谢物的显著积累，提示乳酸引起的胰岛素抵抗并不依赖于上述经典机制。
接着，通过注射¹³C标记的2-脱氧葡萄糖，发现干扰性乳酸注射会直接抑制胰岛素诱导的肌肉葡萄糖摄取和磷酸化。胰岛素诱导的葡萄糖转运依赖于GLUT4向质膜的转位，体外分离肌肉纤维并在暴露于胰岛素之前，用乳酸和丙酮酸处理，发现完全阻断了GLUT4的转位。进一步检测调控GLUT4的调控的胰岛素信号通路，发现尽管胰岛素受体依旧被激活，但其下游PI3K和Akt的磷酸化水平显著下调。
以上结果表明，乳酸的累积破环肌肉中的胰岛素信号以及葡萄糖的摄取，进而抑制乳酸的生成。
7.上述研究的已识别的调控机制使乳酸稳态的定量建模成为可能
上述实验确定了四个机制，这些机制协同作用以维持乳酸稳态：（1）循环乳酸和脂肪酸的竞争性代谢，（2）胰岛素对脂解的抑制，（3）HCAR1对脂解的抑制，以及（4）乳酸对葡萄糖代谢的抑制。为了探讨这些机制的定量相互作用，开发了一个动态模型，通过常微分方程描述禁食期间葡萄糖、乳酸和脂肪酸水平的变化。
该模型描述了代谢物浓度的动态变化，基于时间依赖的生产和消耗通量。乳酸来源于葡萄糖，并与来自脂肪组织脂解的脂肪酸竞争氧化。胰岛素作为唯一的激素，在葡萄糖的刺激下分泌，促进肌肉的糖酵解，同时抑制脂肪组织的脂解。乳酸与HCAR1结合后，也抑制脂肪组织的脂解。此外，乳酸的反馈作用抑制糖酵解。该模型包含19个参数，其中两个是已知的通量（EGP和总呼吸率）。四个参数表征胰岛素的产生和消耗，直接来源于文献。
三个参数设置了每个模型化代谢物在循环系统中的更替时间尺度。代谢物的更替时间取决于池大小与循环流量的比率，池大小是指与循环系统直接交换的代谢物分子数量。这个交换化学池在药物药代动力学中起着核心作用，并可以通过在持续、最小扰动的示踪剂输注后对循环标记的动力学进行测定。实验确定了乳酸、葡萄糖和三种主要循环游离脂肪酸（棕榈酸、油酸和亚油酸）的更替时间。
剩余的十个参数通过观察稳态通量和浓度来计算，其中五个参数经过手动优化，以匹配实验观察到的胰岛素注射反应。优化后的模型能够准确捕捉胰岛素注射后乳酸的循环动力学：糖酵解的快速诱导导致乳酸急剧上升，随后随着脂肪酸水平的下降，乳酸稳态迅速恢复。
模型还被用来模拟胰岛素夹闭实验。计算过程中，通过突然加入外源固定的胰岛素输入并保持葡萄糖恒定，观察脂肪酸和乳酸的反应。结果显示，循环中的胰岛素迅速增加，脂肪酸下降。乳酸浓度在初期轻微上升后，迅速接近其基础稳态，符合实验观察。
8.乳酸稳态在定量上是稳健的
上述研究评估了代谢稳态模型的稳健性。通过使用相图评估模型的稳态，结果表明，无论是在基础稳态还是胰岛素夹闭稳态下，动态变量的等高线均朝向稳态汇聚，表明系统具有稳定性。胰岛素注射后，模型展示了糖酵解诱导下葡萄糖的下降和乳酸的上升，随之脂肪酸减少，乳酸水平随之降低，最终系统恢复到初始稳态。此外，胰岛素夹闭实验中的相图也显示了系统从无胰岛素的稳态到低脂肪酸稳态的平滑过渡，进一步验证了稳态的稳健性。
模型在面对随机扰动时表现出高度的稳健性，代谢物和胰岛素浓度会迅速且一致地恢复至原始稳态。此外，模型对参数值变化的稳定性也得到验证，所有测试的参数变化都未影响系统稳定，代谢物浓度的变化始终小于参数值变化。
进一步的分析表明，缺乏HCAR1或乳酸反馈对糖酵解的抑制对代谢产生轻微影响，而去除胰岛素则显著导致高血糖、高脂血症和高乳酸血症，这强调了胰岛素在维持代谢平衡中的关键作用。此外，HCAR1和胰岛素同时缺失时，不仅复制了胰岛素缺乏症状，还导致显著的代谢紊乱，说明HCAR1在胰岛素水平低时能够增强代谢的韧性。
总体而言，这些分析结果确认了实验中发现的代谢稳态机制的稳健性。
研究内容
此研究系统揭示了乳酸稳态的调控机制，填补了对其维持过程理解不足的空白。乳酸是体内流动速率最高的代谢物之一，由糖酵解产生，并通TCA循环氧化和糖异生途径清除。尽管乳酸水平升高与严重疾病相关，其稳态维持机制却尚不明确。
研究在小鼠中发现，乳酸的产生和清除受多个稳态调控回路控制。胰岛素通过促进糖酵解诱导乳酸生成，而乳酸水平升高又反过来抑制胰岛素诱导的糖酵解，从而抑制乳酸的过量产生。此外，研究出人意料地发现，胰岛素还通过降低与乳酸竞争线粒体氧化的脂肪酸浓度，间接促进乳酸的TCA循环氧化。
同时，乳酸自身也能通过激活脂肪细胞表达的G蛋白偶联受体HCAR1，降低循环脂肪酸水平，从而增强其自身的氧化利用。这些机制共同作用，形成一个相互反馈、自我调节的系统。
借助定量建模，研究进一步验证了这些机制足以维持乳酸稳态，并具有对扰动和随机波动的高度稳健性。总体而言，该研究表明，乳酸稳态是通过对糖酵解与脂解的协调调节实现的，为理解代谢稳态网络提供了新的理论支持。
创新点
葡萄糖、脂质和乳酸是哺乳动物碳源循环的三大类，葡萄糖与脂质之间的代谢调控已有广泛的研究，而乳酸与其之间的相互作用很少有研究，此文章作者发现了调控乳酸稳态的独特调控方式。并证明乳糖增多抑制甘油酸-3-磷酸抑制糖异生作用是胰岛素抵抗的原因之一。型综合考虑了代谢物之间、激素与代谢物之间、以及组织之间的动态相互作用，展示了乳酸稳态依赖于脂肪酸氧化、胰岛素调节、HCAR1信号通路以及乳酸对糖酵解的反馈抑制等多个因素的协同作用。