除了在戏剧、歌剧和电影中，伊丽莎白女王著名地从未见过她的表亲苏格兰女王玛丽。然而，从 1558 年 11 月 17 日伊丽莎白继位，到 1587 年 2 月 6 日玛丽被处决，她们充满矛盾的关系主导了英国的政治生活，最终催生了玛丽作为浪漫牺牲品、伊丽莎白作为残忍刽子手的流行名声。相互冲突的利益和需求给她们的互动蒙上了阴影并留下了创伤，但将她们的关系简单描绘成一场决斗是错误的。¹ 玛丽极其希望被指定为伊丽莎白的继承人，而伊丽莎白也同样迫切地希望玛丽能保证不会密谋反对她。尽管如此，除了短暂的时期（在她前往法国接近生命尽头以及被囚禁在英格兰期间），玛丽并没有试图夺取伊丽莎白的王位；而且，直到玛丽生命的最后几个月，伊丽莎白都没有寻求这位苏格兰女王的毁灭。事实上，在很长一段时间里，伊丽莎白都充当着玛丽的保护者，抵御着英格兰境内那些渴望她流血的人。
两位女王之间不信任和敌意的最初根源，是天主教徒玛丽对新教徒伊丽莎白王位的“虚假宣称”。伊丽莎白刚一继承王位，玛丽就在自己的纹章上 quartered 英格兰的纹章，并在她苏格兰女王和法国王太子妃的其他头衔之外，加上了“英格兰和爱尔兰女王”的称号。她的公公（法国国王亨利二世）于 1559 年 7 月去世后，她成为法国王后，之后仍继续这样做。² 当然，言下之意是，作为私生女，伊丽莎白不可能是合法的君主；人们担心的是，英格兰国内外的天主教徒会聚集在玛丽周围，支持她成为合法的君主。从伊丽莎白在法国的大使那里传来消息，法国国王急于“谋求法国女王对英格兰的权利”。³ 玛丽后来声称，在这件事上她没有主动，只是遵循了她公公（法国国王亨利二世）、她的丈夫（法国国王弗朗索瓦二世）以及她的母系叔叔们（吉斯公爵弗朗西斯和洛林枢机主教夏尔）的指示。但不管真假，玛丽的行为让伊丽莎白感到不安，并播下了不信任的种子，这些种子从未被根除。
事实上，当玛丽拒绝批准 1560 年 7 月英格兰、法国和苏格兰之间谈判达成的《爱丁堡条约》时，不信任感进一步加剧。该条约是在苏格兰一场短暂战争结束时签署的，这场战争始于伊丽莎白向苏格兰新教贵族提供军事援助，这些贵族拿起武器反抗玛丽的母亲——出生于法国的天主教摄政王吉斯的玛丽。⁴ 法国曾支持摄政王，而伊丽莎白则代表她的同宗教者进行了干预。尽管英国军队的战斗并不顺利，但《爱丁堡条约》确保了伊丽莎白最重要的战争目标，包括玛丽宣布放弃对伊丽莎白王位的直接要求，并承诺永远“从今往后”不再使用“英格兰和爱尔兰的风格、头衔和武器”。⁵ 但玛丽对这一点犹豫不决。她抗议说，这些措辞对她未来可能提出的英格兰女王的要求不利，如果伊丽莎白无嗣而终，这会剥夺她的继承权。因此，她希望修改这一条款。⁶