微生物通过饮食信号来诱导白色脂肪的米色化
机体中的脂肪主要包括棕色脂肪和白色脂肪。棕色脂肪因为拥有高线粒体含量从而具有产热功能,并且脂滴也呈现出多腔的结构。而白色脂肪因为线粒体含量较低所以主要具有能量储备的功能，因此具有单腔大脂滴的结构。然而，白色脂肪具有很好的可塑性，例如在寒冷和儿茶酚胺刺激等特定条件下能够获得类似棕色脂肪的特性,这一过程被称为“米色化”，从而产生以线粒体生物合成增强、产热及脂质氧化相关基因表达为特征的米色脂肪细胞。
目前多种研究表明肠道菌群可以通过响应饮食信号来促进白色脂肪的米色化，例如间歇性饮食通过改变肠道菌群从而增加乙酸和乳酸的产生从而促进了白色脂肪的米色化。
结果
1.LPDs 促进 WAT 棕色化
作者首先通过配制不同蛋白质、碳水化合物和脂肪比例的饮食，来研究饮食调整对腹股沟白色脂肪组织（ iWAT）米色化的影响。结果显示无论脂质和碳水化合物含量怎么变，只有低水平蛋白质饮食喂养的小鼠才会显著增加米色化标志基因Ucp1和Cox7a1在iWAT中的表达水平。
此外在低蛋白饮食下iWAT的组织重量也显著减少，组织学特征上也观察到脂滴呈现多腔的结构。这些表型都在提示低蛋白饮食可能促进了脂肪的米色化。
为了验证上述结果，作者接下来对小鼠的饮食设置了不同浓度梯度的蛋白含量，其中正常饮食下的蛋白含量是20%。结果显示当蛋白含量减少到7%或者更低时，iWAT中的Ucp1、Elovl3和Cox7a1被强烈的诱导表达。WB、H&E染色和免疫荧光染色的结果也证实了在低蛋白含量下UCP1含量上调，脂肪出现米色化表型。在之前的动物实验中，饮食干预的周期为6周，为了进一步探究低蛋白饮食在时间进程上对米色化的影响，作者对小鼠给予不同时长的7%低蛋白饮食。结果显示米色化标记基因在饲喂7%蛋白质饮食2周内就可被明显的诱导，并在第6-8周的时候达到平台期。
RNA测序结果也显示低蛋白饮食给予6周后，线粒体功能、产热和脂质代谢的基因被上调。并且这一转录谱的变化，与β3-肾上腺素能受体激动剂诱导脂肪组织米色化的谱系高度相似。除了iWAT之外，低蛋白饮食也在短期内导致棕色脂肪细胞（ BAT）中Ucp1、Elovl3和Cox7a1表达的增加，但是这种增加的幅度低于在iWAT中观察到的结果。
而在全身代谢中，低蛋白饮食可以显著降低小鼠的体重、全身的脂肪体积和iWAT的质量，并增强葡萄糖的耐受性。除此之外，为了排除低蛋白饮食对肠道脂质吸收功能的影响，作者还对粪便中的能量以及13C标记的棕榈酸在肠道中的吸收情况进行了检测，结果显示低蛋白饮食并不影响肠道的脂质吸收。此外作者还对小鼠全身瘦肉体积和腓肠肌的质量进行了评价，从而证实了低蛋白饮食对肌肉萎缩并无影响。这些结果表明低蛋白饮食在促进脂肪米色化的同时总体的耐受性良好，并没有出现严重的不良反应。
因为温度可以影响脂肪的米色化程度，作为为了排除温度造成的假阳性结果，所以在热中性30℃的条件下也进行了实验，结果也显示低蛋白饮食促进脂肪的米色化并不受温度的影响。除此之外作者还在不同品系的小鼠上也观察到了一致的结果，从而进一步排除了小鼠品系对其的影响。
然而，与雄性小鼠或年轻小鼠相比，雌性小鼠或老年小鼠分别表现出减弱的米色化。此外，性腺白色脂肪组织（ gWAT）也没有表现出米色标志基因的上调。
此外在低蛋白饮食后将小鼠的饮食恢复到正常的饮食之后，观察到米色化标志基因的表达和细胞形态状态的明显减弱，表明低蛋白饮食诱导的iWAT的米色化是可逆的。
而当小鼠从高脂饮食切换到低蛋白饮食时，也还能观察到了iWAT中Ucp1表达增加和小鼠整体代谢的改善。
当小鼠从高脂饮食切换到高脂低蛋白饮食时，依旧观察到了iWAT中Ucp1表达增加和小鼠整体代谢的改善，但是我们可以看到这种诱导的幅度随着长期或更大量的脂肪暴露而减弱。总的来说，这些结果表明低蛋白饮食诱导iWAT的米色化是非常显著的，但是这种作用具有脂肪的特异性，比如前面结果中gWAT不受其影响，并且该结果还受到年龄、性别和饮食背景的调节。
考虑到蛋白质的类型和消化率对结果的影响，作者随后研究了含有特定氨基酸而非天然蛋白质的饮食。结果显示降低膳食氨基酸含量可导致iWAT中米色标志基因的表达显著增加，在氨基酸含量为5%或更低时达到最大的效果，与之前7%低蛋白饮食观察到的效果相当。然后作者又对将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸进行研究，结果显示减少必需氨基酸重现了总氨基酸限制所观察到的米色标志基因诱导，而限制非必需氨基酸则没有明显效果。随后作者研究了减少饮食中每种单个必需氨基酸对米色化的影响。结果显示减少单个必需氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸）导致米色化有轻微且不一的效果。这些结果表明，尽管限制单个必需氨基酸效果有限，但如果同时限制几种必需氨基酸会通过互补途径驱动更强烈的米色化反应。
2.‌低蛋白饮食（LPD）诱导的脂肪褐变确实依赖肠道菌群‌
作者接下来对低蛋白饮食促进iWAT米色化的作用机制进行了探究。结果显示用低蛋白饮食喂养小鼠的米色化诱导水平与冷刺激或β3-肾上腺素能受体激动剂引起的儿茶酚胺刺激所产生的效果相当。值得注意的是，将低蛋白饮食与冷刺激相结合，会导致米色脂肪标志基因的表达出现叠加性增加，这表明其中涉及了不同的米色化机制，而儿茶酚胺刺激并未出现叠加现象。除此之外，免疫细胞也被报导可参与米色化过程，因此作者随后在多种免疫缺陷小鼠上进行验证，发现低蛋白饮食依旧具有米色化作用，因此作者认为其不依赖于免疫相关的机制。
随后作者利用无菌（ GF）小鼠评估了肠道微生物群在低蛋白饮食诱导米色化中的作用。结果显示，GF小鼠在喂食低蛋白饮食后米色化作用明显减弱，包括米色化标记基因表达的降低，组织学多腔结果的减退，体重和iWAT质量的上升。从而说明低蛋白饮食诱导iWAT米色化需要肠道菌群。但是值得注意的是，在GF小鼠中低蛋白饮食诱导的米色化作用虽然减弱，但并未消失，依旧可以观察到Ucp1等标志基因的低水平诱导，表明还存在一条不依赖于微生物群的机制通路，尽管这种反应并不是很强烈，后续作者也没再讨论与探究。
除此之外在饲喂低必需氨基酸饮食的小鼠中也观察到了类似的趋势。同时用抗生素鸡尾酒疗法处理小鼠来清除小鼠的肠道微生物后，也导致其iWAT中Ucp1、Elovl3和Cox7a1的表达显著降低。总之这些发现表明，微生物群是低蛋白饮食介导iWAT米色化的关键驱动因素。
3.低蛋白饮食（LPD）-肠道菌群-FXR通路在白色脂肪组织“棕色化”中的作用机制‌
为了进一步鉴定可能参与iWAT米色化的关键微生物代谢物。作者对饲喂对照饮食或低蛋白饮食的无特定病原体（SPF）小鼠和GF小鼠的血浆样本进行了非靶向代谢组分析。结果显示，低蛋白饮食增加SPF小鼠血浆中非结合型胆汁酸的水平，包括胆酸（CA）和鼠胆酸（MCA）。随后的靶向代谢组分析证实，与GF小鼠及饲喂对照饮食的SPF小鼠相比，饲喂低蛋白饮食的SPF小鼠血浆中CA、αMCA、βMCA、鹅去氧胆酸（CDCA）以及7α-和7β-脱羟基化产物的水平升高，但在回肠中并未观察到此类的趋势。
这些胆汁酸在体外FXR报告基因实验中表现出激动活性。因此，作者接下来研究了FXR信号是否参与了米色化。结果显示当FXR敲低后，Ucp1和Elovl3的诱导显著减少，组织学上的米色细胞数量也减少。而相比之下敲除另一个重要的胆汁酸受体TGR5并不影响低蛋白饮食诱导的米色化。这些发现表明，在低蛋白饮食喂养期间，微生物源胆汁酸至少部分通过一条依赖FXR但不依赖TGR5的途径促进iWAT的米色化。
鉴于FXR在肠道、肝脏和白色脂肪组织中都有广泛的表达，作者后续使用了组织特异性FXR敲除小鼠来确定FXR信号对iWAT米色化的器官特异性贡献。结果显示在肠上皮细胞或肝细胞中特异性敲除FXR并不影响低蛋白饮食诱导的Ucp1和Elovl3的表达。相比之下，脂肪细胞特异性敲除FXR显著降低了iWAT中Ucp1和Elovl3的表达以及组织学上的米色细胞数量，表明FXR在脂肪组织中具有关键作用。
为了鉴定iWAT中表达FXR的细胞类型，作者随后对饲喂对照饮食或低蛋白饮食的SPF和WT小鼠的iWAT进行了单细胞测序。结果显示表达Ucp1的米色细胞簇几乎只在饲喂低蛋白饮食的SPF小鼠中被检测到。而FXR则主要在脂肪干细胞和祖细胞中表达。因为脂肪干细胞和祖细胞的标志物为Dpp4，所以随后作者在DPP4阳性细胞中特异性敲除FXR，结果显示当Dpp4阳性细胞中敲除FXR后显著减弱了低蛋白饮食喂养后Ucp1和Elovl3的诱导。从而进一步说明是脂肪干细胞和祖细胞中的FXR在低蛋白诱导的米色化中至关重要。
4.低蛋白饮食调节的肠道菌群驱动肝脏FGF21的产生
鉴于低蛋白饮食诱导iWAT米色化的效应非常显著，而敲除FXR后效果并未完全清除。因此作者推测除了胆汁酸-FXR轴之外，可能还涉及到多条复杂的通路。考虑到肝脏在调节饮食代谢反应中的核心作用，作者接下来对肝脏样本进行了RNA测序和定量PCR分析。结果显示，在SPF小鼠中，而不是在GF小鼠中，饲喂低蛋白饮食1周或6周均能持续诱导包括Phgdh、Psat1、Aldh1l2和Asns在内的多个基因的表达。由于这些基因在丝氨酸生物合成、线粒体一碳代谢和氨依赖性天冬酰胺生成中发挥作用，因此作者猜测它们的诱导意味着肠道微生物群参与了肝脏氮循环的过程，从而未后续的机制研究埋下了伏笔。已知这些基因受ATF4的调控，并且一致地，其他ATF4诱导基因也以微生物群依赖的方式类似地上调。值得注意的是，β3-肾上腺素能受体激动剂处理并未诱导此转录反应，这凸显了肝脏中微生物群依赖性信号传导的独特性。
除此之外，另一个ATF4诱导基因Fgf21在SPF小鼠的肝脏中显著上调，而在GF小鼠中则有所下调。且循环血浆中的FGF21水平也相应增加。当对Fgf21进行全身敲除后，低蛋白饮食促进iWAT米色化的作用也随之消失。然而，对饲喂对照饮食的GF小鼠施用重组FGF21蛋白不足以诱导iWAT的米色化，这表明还需要其他微生物群依赖性信号的参与，比如胆汁酸-FXR轴。
那FXR和FGF21这两条机制是相互独立的还是相互包容的呢？作者随后对Fgf21敲除小鼠和FXR敲除小鼠的iWAT基因表达谱进行了比对，结果显示两种通路具有不同的基因表达模式。
在单细胞数据集中，FXR和Fgf21在iWAT的不同细胞群体中表达。此外，Fgf21敲除并不影响小鼠血浆中的胆汁酸含量；同时，FXR敲除也不影响小鼠血浆中FGF21的含量。这些发现表明，FXR和FGF21通过平行、非冗余的通路发挥作用，共同促进iWAT中米色脂肪细胞的诱导。
5.‌Microbiota-FXR-FGF21是一条由肠道微生物、胆汁酸受体FXR、代谢激素FGF21与交感神经系统共同构成的跨器官信号通路，近期研究揭示其在调控脂肪组织“棕色化”、能量代谢及体重稳态中发挥关键作用。
那FXR和FGF21诱导米色化的机制又是什么呢？由于儿茶酚胺信号是脂肪米色化的核心，而儿茶酚胺通过β-肾上腺素能受体发出信号，因此作者接下来评估了低蛋白饮食介导的米色细胞诱导在β1-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体或β3-肾上腺素能受体缺陷小鼠中的情况。结果显示，β3-肾上腺素能信号传导的缺失时，无论是单独缺失还是与β1或β2缺失相结合，都会导致米色细胞诱导严重受损，而敲除β1或β2受体则没有影响，这表明低蛋白饮食诱导的米色化特异性地依赖于β3-肾上腺素能受体信号的传导。与此一致，iWAT的免疫染色显示，在SPF小鼠中喂食低蛋白饮食时，作为儿茶酚胺发射器的酪氨酸羟化酶阳性的交感神经元发生了显著重塑，但在GF小鼠中则没有。具体来说，交感神经元形成了更精细、更密集的网络，尤其是在表达UCP1的细胞强烈聚集的区域。相比之下，饲喂低蛋白饮食的Fgf21敲除和FXR敲除小鼠的交感神经元并未显著重塑，与在无菌小鼠中观察到的结果相似。
给予β3-肾上腺素能受体激动剂，能使饲喂对照饮食的GF小鼠以及FXR敲除小鼠和Fgf21敲除小鼠的Ucp1和Cox7a1表达增加，达到与饲喂低蛋白饮食的SPF小鼠相当的水平。这些发现表明，在低蛋白饮食诱导的米色化过程中，FXR和FGF21通过不同的信号通路发挥作用，这些通路最终都是依赖于交感神经和β3-肾上腺素能信号来发挥米色化的作用。
在前面作者已经通过GF小鼠证实了肠道菌群参与了米色化的过程，那这种米色化的过程又是否可以通过肠道菌群传递呢？为此作者进行了小肠内容物的菌群移植实验，并做了2个平行实验。结果显示不管GF小鼠的菌群是来源于A还是B，在低蛋白诱导下都观察到了米色化现象，即使后面使用粪便进行移植也展现出了相同的结果。证实低蛋白饮食诱导的米色化过程可以通过肠道菌群传播。接下来作者想寻找能够介导米色化的微生物群落，按照常规思路我们接下来可能直接会进行16s测序分析或宏基因组分析。但是有意思的是，作者先是挑选了Ucp1表达水平最高的B28小鼠，并将B28小鼠的小肠内容物转移到新的GF小鼠中，重现了米色化的现象，随后作者继续选取其中Ucp1表达水平最高的B28-1小鼠，用于后续的16s测序和单菌分选，这样一整个流程下来更加确定了菌群与米色化的因果关系，并且也排除了一些混杂的因素。
6.根据目前可查的公开资料，‌没有直接证据或研究报告表明“20种细菌菌株在小鼠体内诱导了褐变（browning）”这一现象
在前面作者已经通过GF小鼠证实了肠道菌群参与了米色化的过程，那这种米色化的过程又是否可以通过肠道菌群传递呢？为此作者进行了小肠内容物的菌群移植实验，并做了2个平行实验。结果显示不管GF小鼠的菌群是来源于A还是B，在低蛋白诱导下都观察到了米色化现象，即使后面使用粪便进行移植也展现出了相同的结果。证实低蛋白饮食诱导的米色化过程可以通过肠道菌群传播。接下来作者想寻找能够介导米色化的微生物群落，按照常规思路我们接下来可能直接会进行16s测序分析或宏基因组分析。但是有意思的是，作者先是挑选了Ucp1表达水平最高的B28小鼠，并将B28小鼠的小肠内容物转移到新的GF小鼠中，重现了米色化的现象，随后作者继续选取其中Ucp1表达水平最高的B28-1小鼠，用于后续的16s测序和单菌分选，这样一整个流程下来更加确定了菌群与米色化的因果关系，并且也排除了一些混杂的因素。
从小鼠B28-1的小肠内容物中，作者首先分离出了18株细菌。但是，用这18株细菌混合体定植GF小鼠不足以高效的诱导米色化。因此作者又从B28-1的小肠内容物中又分选出了2株细菌。从而得到了一个包含20株细菌的联合体，这个联合体在低蛋白饮食喂养后能强烈诱导米色化，达到与SPF小鼠相当的水平，表明这两株细菌对于该联合体是必需的。
与此相一致的是，这20株菌株组成的联合体也显著增加了GF小鼠血浆值中CA、CDCA、7oxoDCA、熊果胆酸（ursocholic acid，UCA）、熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）以及FGF21的水平。而在FXR和Fgf21的敲除小鼠中，该联合体促进米色化的作用则显著减弱，进一步了证实肠道微生物发挥米色化的作用需要FXR和FGF21信号的传导。
7.四种源自人类的分离物促进褐变
在确定一个小的菌落联合体就可以促进低蛋白饮食诱导的米色化之后，作者加下来就将目光放在了人类微生物群中，试图鉴定能够发挥此活性的人类相关微生物。为此作者招募了25名健康志愿者并进行了18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描，该技术可检测米色或棕色脂肪。结果显示约40%的志愿者在锁骨上区检测到产热脂肪的存在。作者接下来将信号最高的四位志愿者T17，T10，T19和T18的粪便样本移植给无菌小鼠，并将小鼠置于对照饮食或低蛋白饮食下。结果显示，在用来自供体T17、T10和T19微生物群定植的无菌小鼠中，低蛋白饮食喂养诱导了iWAT的米色化。而来自供体T18的效果却差得多，作者推测可能是由于关键效应菌株未能成功定植引起的。除此之外，作者还将表现出中等的供体FF2和没有信号的供体T07的粪便移植给无菌小鼠。结果显示，FF2受体小鼠表现出中等程度的米色化，而T07受体小鼠则未显示米色化迹象。这一实验结果也进一步强化了人类供体菌群与米色化表型之间的因果关系。
接着，作者从接受了T10微生物群移植的小鼠粪便中分离出33株菌，并从接受了T19微生物群移植的小鼠粪便中也分离出另外33株菌。用这33株混合体分别定植到无菌小鼠中。结果显示用T19来源的33株混合体诱导的米色化效果更好，而用T10来源混合体定植的小鼠诱导程度则相对低一些。
与此一致的是，T19来源的33株混合体定植的小鼠，其血浆中胆汁酸以及FGF21的水平均升高。而敲除FXR和FGF21后该效果消失，这与小鼠上20株菌的混合体结果类似。
为了鉴定最小的效应菌联合体，作者随后首先将33株T19来源的微生物按照门水平分为2大组：一个是以拟杆菌门为主的19株菌，另一个则是以厚壁菌门为主的14株菌。结果显示19株菌这一组完全复现了33株菌的效果。随后作者又将这33株菌按照属水平分为了5类菌群复合体，并依次进行了菌群缺失实验，结果显示只有被归类为其他属的5株菌复合体缺失时才导致了Ucp1诱导的最大程度降低，而单独给予这5株菌也非常好的诱导了Ucp1的表达。
相一致的是，这5株菌复合体也显著增加了血浆中相关胆汁酸的含量，同时上调了肝脏中Fgf21的基因水平。
此时作者为了进一步精简这5株菌，进行了额外的剔除实验，而且每次只剔除一株菌，结果显示仅有St29这株菌在缺失后并不影响Ucp1的表达，因此作者后续将这个菌从组合里面剔除了。除此之外作者还发现St31菌缺失的时候会验证影响其余菌的定殖能力，表明St31这株菌在组合中通过促进其他菌的增殖从而起到支持的作用。
接下来，为了评估新的4株菌复合体的作用，作者用缺乏米色化能力的参与者T07的粪便接种无菌小鼠，并饲喂高脂饮食。然后用低蛋白饮食单独处理或联合2次4株菌复合体的口服处理。结果显示，联合四株菌治疗显著降低小鼠体重，增加iWAT和BAT中Ucp1和Elovl3的表达，增加肝脏中Fgf21表达，降低iWAT质量，降低血浆胆固醇、甘油三酯和ALT的水平，以及改善了葡萄糖耐量。表明由这4种特定微生物群组成的混合体介导了低蛋白饮食引起的iWAT米色化以及随后表现出的代谢益处。
8.微生物产生的氨诱导肝脏分泌成纤维细胞生长因子21（FGF21）
而为了阐明4株菌组成的复合体如何促进低蛋白饮食诱导的米色化，作者接下来检测了它们的胆汁酸代谢能力。结果显示所有菌均均能在体外将牛磺胆酸转化为胆酸，从而表现出胆盐水解酶活性。此外，支持菌株St31具有额外的7α-HSDH酶的活性，能够独特地将牛磺胆酸转化为7oxoDCA，这可能促进了其他菌株的定植以及iWAT中FXR的激活。接下来，作者对33株T19来源菌株进行了基因组测序，并对定植了该联合体并饲喂对照饮食或低蛋白饮食的无菌小鼠的盲肠微生物群进行了转录组分析。结果显示低蛋白饮食喂养选择性地上调了之前的有效菌群19-BEEO和hu4中氮代谢相关基因的表达，但在之前无效的菌群14-RL或14-BEE菌群中没有。值得注意的是，在低蛋白饮食喂养后，编码催化亚硝酸盐还原为氨的酶的nrfA基因在St.14和 St.3中的表达大幅增加。这一结果也与之前在肝脏转录组中发现肠道微生物群可能参与了肝脏氮循环过程的结果相呼应。
与大多数nrfA同源基因不同，这些菌株中的nrfA基因独特地含有脂蛋白信号肽（ LSP）。这种信号肽能将NrfA定位到内膜，从而有能力将周质中的亚硝酸盐还原为氨。主要工作原理是NrfA通过其伙伴酶甲酸脱氢酶（ FDH），利用甲酸作为电子供体，从而将亚硝酸盐还原为氨。其中钨处理可以抑制FDH酶的活性。
因此作者在后续实验中在饮用水中添加钨来抑制氨生成能力，结果显示添加钨之后显著抑制了定植19 BEEO混合菌株小鼠的iWAT米色化和血浆FGF21水平，且不改变菌株定植能力和血浆的胆汁酸水平。
为了进一步评估NrfA在iWAT米色化中的作用，作者随后构建了nrfA缺陷的St.14突变体。与野生型菌株相比，该突变体在体外表现出产氨缺陷。在体内，将野生型St.14菌株与产胆汁酸的St.31共同定植于无菌小鼠中可诱导显著的米色化，尽管其程度远低于完整的hu4混合体菌株。但是相比之下，用St.31和 St.14突变体共定植则未能诱导米色化。与此一致的是，低蛋白饮食喂养增加SPF小鼠以及定植了野生型St.14和St.31的无菌小鼠门静脉中的氨水平，但未增加外周血中的氨水平。相比之下，在无菌小鼠或定植St.14突变菌株的小鼠中未观察到氨的显著增加。而当给小鼠补充氯化铵则可以挽救这类现象。此外，用氯化氨刺激不同的人源肝细胞类器官也能以剂量依赖的方式诱导FGF21的表达，而不影响胆汁酸生物合成基因的表达。这些结果表明，微生物来源的氨进入门静脉循环并选择性诱导肝脏FGF21表达，从而促进白色脂肪组织米色化。
小结
综上所述，该研究发现低蛋白饮食通过改变肠道微生物群，促使特定菌群（如产氨菌和胆汁酸修饰菌）产生更多的胆汁酸和氨；胆汁酸激活脂肪组织中的FXR受体，而氨则诱导肝脏分泌FGF21。这两条通路相互平行且非冗余，共同增强交感神经支配，从而促进iWAT的米色化，最终改善整体代谢。